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小伙伴们做流式时通常会遇到调补偿的问题，为啥调补偿，不调补偿怎么样，怎么调补偿？小E哥在这里与大家一起分享自个儿关于调补偿的经历!

?  调节补偿，Why？

图1分别为FITC、PE、PE-eFluor 610、PE-Cy5、PE-Cy7的发射光谱，其发射光谱范围一般在100-200nm之间，如同时用488nm的激光器去激发，虽然每个染料都有对应它最大发射波长的滤光片来接收荧光信号，但如果染料的发射光谱较宽，该染料的发射光就会被不止一个通道接收。

以图中的PE染料为例，PE通道接收的信号除了PE外还有FITC、PE-eFluor 610、PE-Cy5、PE-Cy7。为了大家检测的是单独的PE信号，就需要设置单染管进行荧光补偿的调节，进而去除其他荧光的干扰。

图1  FITC、PE、PE-eFluor 610、PE-Cy5、PE-Cy7的发射光谱

图2  将FITC、PE-eFluor 610、PE-Cy5、PE-Cy7的荧光从PE通道中去除的模式图

?  如何调节补偿，How？

①　不加药处理的阴性细胞调节FFC、SSC电压，加药处理的只加一种染料的阳性细胞调节该通道的电压。

②　加药处理的只加一种染料的阳性细胞调节补偿。

③　补偿调节好后，用加药处理过的双染管上流式。

以调节FITC和PE之间的补偿值为例如下表进行设置：

FITC单染管：FITC荧光渗漏到PE通道，大家需要设置FITC单染管，将渗漏进PE通道的FITC荧光信号去除，也就是得出PE-FITC补偿值。

PE单染管：PE荧光渗漏到FITC通道，大家需要设置PE单染管，将渗漏进FITC通道的PE荧光信号去除，也就是得出FITC-PE补偿值。

?  不设置补偿调节对结果有什么影响，If not?

有小伙伴觉得设置荧光补偿麻烦，哼，不设置了，那一起来看下结果吧。

如图3-A列所示是荧光补偿调节之前的流式结果，分别是FITC单染管、PE单染管、双染管的流式图，图3-B列所示是荧光补偿调节过度的流式结果，图3-C是补偿调节不够的流式结果，图3-D是荧光补偿正确的流式结果。

没有设置补偿调节组各个象限细胞比例与设置补偿正确组相差大，且分群不美观，而补偿调节不够或过度也会引起象限内细胞比例产生偏差，且分群不美观。

图3  补偿对结果的影响

?  哪些因素会影响补偿的调节？Which?

①　电压：电压变荧光补偿变，大家需要先调节FSC、SSC电压和荧光通道的电压然后调节补偿值。

②　荧光染料本身的光谱特性和荧光强度：先根据流式细胞仪的配制，包括激光器、光路设计以及滤光片等，确定有哪些染料可用，后选择发射光谱重叠较小的荧光染料。

③　细胞：当细胞的理化性质相差较大时，流式结果可能不尽相同。如标记相同的荧光素偶联抗体，使用相同的通道，但样品细胞分别是活细胞与固定后细胞时，得到的流式结果可能就不一样。所以当细胞理化性质差异较大时，最好重新调节新的样品细胞的补偿，确保获得准确的流式结果。

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